細(xì)胞與克隆技術(shù)論文
克隆技術(shù)是眾多具有極大影響力的技術(shù)之一。下面是小編精心推薦的細(xì)胞與克隆技術(shù)論文，希望你能有所感觸!
家兔克隆骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)
【摘要】 目的：探討家兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外傳代的培養(yǎng)。方法 取家兔股骨骨髓，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，于1640培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，之后固定計(jì)數(shù)。結(jié)果 在2~6×106 個(gè)/cm2范圍內(nèi)，其接種細(xì)胞數(shù)與所形成的克隆集落(CFU-F)數(shù)呈良好線性關(guān)系。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，克隆集落也增多，變大。3周齡家兔的造血基質(zhì)祖細(xì)胞較6周齡者為多。結(jié)論 基質(zhì)祖細(xì)胞CFU-F呈非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。
【關(guān)鍵詞】 家兔;骨髓;造血基質(zhì)祖細(xì)胞;克隆
骨髓基質(zhì)細(xì)胞是支持和調(diào)節(jié)造血細(xì)胞定居、增殖、分化、發(fā)育和成熟的內(nèi)環(huán)境主要細(xì)胞成分[1]。曾對(duì)小鼠體外單層培養(yǎng)造血基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)其接種的細(xì)胞數(shù)與成集落數(shù)呈良好的線性關(guān)系[2]。目前對(duì)家兔的骨髓器官基質(zhì)細(xì)胞的研究國內(nèi)研究有過報(bào)道[3]。本文用體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞技術(shù)[4]對(duì)家兔的骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)進(jìn)行了探討。
1 資料與方法
1.1 材料來源 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物系北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心飼養(yǎng)的雌雄兩性、3~6周齡之純種家兔。
1.2 主要試劑與器材 RPME1640培養(yǎng)液，小牛血清(中國藥品生物制品檢定所)，平底中性玻璃培養(yǎng)瓶，二氧化碳孵箱，微孔濾網(wǎng)。
1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞制備 6周齡家兔用乙醚麻醉處死;3周齡者則用頸椎脫臼致死。在無菌條件下取雙側(cè)股骨修潔后剪掉骺端，用帶16號(hào)針頭注射器以1640培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，再用濾網(wǎng)過濾制取單個(gè)核細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用所需細(xì)胞量進(jìn)行體外CFU-F培養(yǎng)。
1.4 CFU-F培養(yǎng)和測(cè)定 將6周齡家兔的骨髓細(xì)胞以2×106 個(gè)/cm2, 3周齡的以2~6×106 個(gè)/cm2置于含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系的培養(yǎng)瓶中，于37℃，5%CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于第4天，第6天用含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液換液，培養(yǎng)到第八天沖洗后用甲醛固定半小時(shí)，蒸餾水沖洗后用姬姆薩染色12 min后晾干，待計(jì)數(shù)用。
2 結(jié)果
2.1 CFU-F克隆集落形成過程觀察 于培養(yǎng)第4天在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)淡紅色背景下(紅細(xì)胞)有圓形發(fā)亮的.較大基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，拉長(zhǎng)的細(xì)胞較少見，振蕩后觀察未見發(fā)亮細(xì)胞浮起，說明細(xì)胞已貼壁。培養(yǎng)第六天鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞明顯增多，拉長(zhǎng)者較多，形成了克隆集落，6周齡的骨髓基質(zhì)細(xì)胞 生長(zhǎng)速度明顯低于3周齡者，且培養(yǎng)同天數(shù)的6周齡的克隆集落數(shù)明顯低于3周齡的克隆集落數(shù)。
2.2 CFU-F計(jì)數(shù) 計(jì)數(shù)由50個(gè)以上細(xì)胞所形成的集落數(shù)，結(jié)果如圖1、2和表1。由50~99個(gè)細(xì)胞組成的集落為小集落，由100~199個(gè)細(xì)胞組成的集落為中集落，>200個(gè)細(xì)胞者的為大集落。
3 討論
從以上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，形成克隆集落相對(duì)越多，3周齡者，骨髓細(xì)胞較多，造血基質(zhì)祖細(xì)胞也較多，形成的克隆集落數(shù)也多。在2~6×106個(gè)/cm2范圍內(nèi)，形成的克隆集落數(shù)與種植細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。
通過對(duì)集落大小，所含細(xì)胞數(shù)與密度比較，表明CFU-F非均質(zhì)性的，可能存在不同亞群。這對(duì)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的增殖與分化有一定的指導(dǎo)意義。
參考文獻(xiàn)
[1] 姚程，彭麗萍，姜振宇,等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外擴(kuò)增能力及支持造血的研究.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,17(4)：386-388.
[2] 于洪臣, 郭占之, 畢曉穎, 等.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1991,17(3):219.
[3] 王春艷，何欣，李增新,等.兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)研究.北華大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,6(6)：520-522.
[4] 蔡國鋒，黃開，章慶國.兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(1)：16-19.
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